宽带飞秒激光器950-1150nm | 瑆创光学电子商店

图 3：在所有细胞膜中表达 GFP 的 2 天大的转基因系斑马鱼胚胎 （Caax-GFP） 尾巴的 TPEF 图像。（A-C）对应于 26、71、150 μm 深度的强度归一化图像。（D）由300张图像（0.71μm步长间距）组成的Z堆栈的完整重新切片图像。比例尺： （A-C） 40 μm;（D） 20μm。

为了测试激光在散射组织中的穿透能力，我们继续以细胞分辨率对大鼠（~170μm）的整个视网膜进行成像。图4显示了使用旋风激光（Δλ=200nm，中心为1060nm）和相干公司MIRA 900激光（Δλ=10nm，中心为810nm）采集的重新切片的TPEF图像的比较。两个切除的大鼠视网膜都用Alexa Fluor 647-鬼笔环肽和Alexa Fluor 405-鬼笔环肽染色，是第一个被该系统激发的，而第二个被相干公司MIRA 900激发。

图 4：SCH（现在称为 Cyclone）和相干公司 MIRA 900 激光的比较，用于分别用 Alexa Fluor 647-鬼笔环肽和 Alexa Fluor 405-鬼笔环肽染色的切除大鼠视网膜（视网膜神经节细胞面朝上）的 TPEF 成像。（A）用激光重新切片376张图像（0.52μm步长间距）。（B） 对使用相干公司 MIRA 404 激光器采集的 0 张图像（50.900 μm 步长间距）进行重新切片。比例尺：15 μm。

在这两种情况下，染色剂都用于可视化视网膜神经元细胞骨架的肌动蛋白。我们使用相同的激光功率和相似的步长间距来构建z堆栈。图像以相同的方式处理以进行后验比较。

在使用系统获取的图像中，我们清楚地区分了表征组织的突触（明亮区域）和核（间隙区域）层。有趣的是，大鼠视网膜在用蓝绿色光谱的光照射时具有高度自发荧光。

此外，包装视蛋白（光色素）的感光细胞的外部部分对可见光具有高度吸收性。因此，红外光谱中的照明源与红色荧光染料相结合是深度成像的理想选择，以防止该组织中产生/扭曲自发荧光。特别是，激光产生了一个高效的系统来成像这些类型的样品。

激光配置的简单性、稳健性和成本效益是支持该技术在各种应用中取代传统固态小周期脉冲源的强大因素。

2. 多光子显微镜I：用15飞秒脉冲增加光子通量

以较短的激发脉冲（15 fs）大量增加光子通量

双光子激发荧光（TPEF）显微镜（也称为双光子显微镜）是活组织深度三维成像的首选方法。深度成像是TPEF显微镜固有的，因为它使用较长的激发波长（近红外），其散射小于共聚焦显微镜中传统上使用的较短可见波长。这减少了来自散射光的背景照明，并增加了更高深度的对比度。例如，使用TPEF显微镜可以实现1mm深度的体内脑图像。

当两个独立的光子同时被介质吸收时，就会发生双光子激发。这需要两个能量合适的光子在这种介质上的时间和空间上重合;一个不太可能的事件，需要非常大的激发光子通量。光子通量越大，两个光子同时被吸收的概率就越高。在TPEF显微镜中，更高的光子通量导致更高的效率，从而提高图像质量和分辨率。

传统上，在TPEF显微镜中，双光子激发所需的大光子通量是通过宽可调的固态飞秒激光器实现的，其脉冲量级为100 fs，实际重复率约为80MHz。它们可以提供非常高的峰值功率和大光子通量水平，这是双光子显微镜的需要。然而，由于基波激发波长的线性吸收，这些激光器提供的平均功率（在1-4瓦的范围内）可能会由于与介质的光热相互作用而造成热损伤。这种效应在温度超过40ºC会导致不可逆转的损伤的体内成像中尤为重要。因此，传统固态激光器提供的平均功率必须衰减才能实际用于TPEF显微镜。这对峰值功率有直接影响，峰值功率也会相应降低。

增加峰值功率、保持低平均功率从而避免热损伤的另一种方法是缩短脉冲持续时间。这减少了光子落在介质上的时间间隔，提高了同时被吸收的可能性。

最近，最先进的超连续全光纤激光器技术首次使脉冲短至15 fs的商用激光器成为可能：旋风。

与传统的100 fs激光器相比，Cyclone的15 fs脉冲导致光子通量达到7倍，平均功率水平相同。

3. 多光子显微镜II：激发脉冲更短的更明亮的图像

在前几周，我们展示了脉冲持续时间为15fs的NIR激光器（如Cyclone）与标准7fs激光器相比，如何提供超过100倍的光子通量，具有相似的重复率和平均功率。

但是，每个时间和面积的可用光子数量的巨大改进对图像亮度的真正影响是什么？

理论上，在双光子显微镜中，图像亮度与激发效率直接相关，激发效率二次依赖于光子通量和荧光团的二阶非线性激发截面（GM）。

例如，我们可以计算荧光蛋白mRFP在1050nm处被15fs激光（例如旋风分离器）照射时的激发效率，与100fs激光器相比。凭借更宽的200nm带宽，15fs激光器在900至1200nm范围内激发mRFP，与11fs激光器的100nm相比，光谱区域要宽得多。

蓝色曲线：旋风15fs全光纤激光器的峰值功率，以1050nm为中心

橙色曲线：以100nm为中心的1050fs光纤激光器的峰值功率

灰色曲线：mRFP的二阶非线性激励截面（GM）

考虑每个波长处的峰值功率和激发截面，可以计算出mRFP的激励效率。结果是，与传统的50fs激光器相比，使用15fs激光器（如旋风分离器）的效率提高了100%。

蓝色曲线：旋风15fs全光纤激光器的峰值功率

橙色曲线：100fs激光的峰值功率

灰色曲线：mRFP的二阶非线性激励截面（GM）

多光子显微镜

用标记细胞核（黄色）的 SYTOX Green 标记细胞核（黄色）和标记肌动蛋白丝（蓝色）的 Alexa Fluor 2 鬼笔环肽染色的小鼠肠道切片的 568P 荧光显微镜图像。

4. 多光子显微镜III：多光子显微镜的新概念

想象一下，同时对各种荧光团进行成像，而不必考虑选择激光器的最佳激发波长。在双光子显微镜中，当使用传统的100fs激发激光器时，这通常是一项复杂的任务，有时甚至是不可能完成的任务。

在红外中发射的变换限制100fs固态激光器的光谱范围为10-20nm，因此，它们只能同时激发激发光谱属于10-20nm光谱的荧光团。

为了用单个激光器同时激发更多种类的荧光团，需要具有更宽带宽和更短脉冲持续时间的激光器。

例如，具有15 fs脉冲的激光器，例如旋风激光器，以1050nm为中心，提供15fs脉冲和200nm的带宽。该带宽内（延伸至900至1200nm）内的所有绿色和红色荧光团都可以被这种激光器同时激发。

这使得多个荧光团的同时成像成为双光子显微镜的可行、实用和简单的替代方案。

小鼠肠道的双光子荧光显微镜图像。部分染色

Sytox Green：标记细胞核（品红色）。FITC过滤器

Alexa Fluor 568 Phaloidin：标记肌动蛋白丝（绿色）。TRITC过滤器

两种荧光标记物同时用旋风激发，荧光用尼康的荧光立方体过滤。

图像拍摄于ICFO-SLN的超分辨率光学显微镜，位于西班牙巴塞罗那的ICFO-光子科学研究所。

致谢 D-SCAN 预压缩机的球体光子学

5. 双光子显微镜的新视野

旋风是用于双光子显微镜的新型飞秒光纤激光器。这是一个新建议，它是不同的。它的核心由专有技术提供动力，能够同时激发种类最多的荧光探针。它提供具有更高亮度的图像。它引入了一个简单和成本的新时代。

旋风分离器提供极宽的光谱带宽，可在900-1200nm光谱的NIR中扩展。这与大多数绿移和红移荧光标记的双光子激发光谱重叠，包括eGFP，mRFP和DsRED。这大大超过了可以与传统飞秒激光器同时激发的荧光标记的范围，包括宽可调激光器和单线飞秒光纤激光器。

Cyclone 提供了一种高度灵活和通用的解决方案或双光子激发荧光显微镜，增强了可以在样品上同时成像的功能，这对于体内和离体显微镜尤为重要。

使用旋风激光激发的花粉自发荧光的花粉粒图像显示了出色的图像质量和不同光谱通道下的同步激发。

不仅频谱更宽，而且旋风分离器还提供更短的脉冲。结合专用的最先进的色散预补偿器，可以在显微镜样品平面上传递15-20fs量级的脉冲。这导致样品平面上具有非凡的峰值功率和无与伦比的光子通量，达到传统飞秒激光器光子通量的7倍以上，脉冲范围在100-200fs。

与优越的旋风峰值功率相关的较大光子通量导致每个面积和时间到达样品的光子数量增加。与脉冲持续时间在49-100 fs范围内的传统固定波长或宽可调激光器相比，这将双光子激发效率提高了200倍。当与荧光标记 DsRED 一起使用时，可实现超过 50% 的效率。

旋风激光器的红移近红外波长与更高的激发效率相结合，可实现更好的图像亮度和更深的穿透力。200微米深的斑马鱼样本由旋风激光简单地成像。

Cyclone 宽光谱带宽不仅可以激发大范围的指示剂，还可以通过一次扫描在 900-1200 nm 范围内进行多色激发，从而可以同时激发不同的探针。这消除了与宽可调激光器相关的显微镜对准问题。

小鼠肠道和锥体的图像说明了使用旋风激光器的宽带宽照射这些样品时可以实现的高质量图像质量。

Cyclone 在 200-900nm 光谱范围内提供 1200 nm 的带宽，脉冲为 15 fs，重复频率为 75MHz，增强了双光子激发，并能够单独或同时激发丰富的指标。